小鼠組織蛋白酶B(CTSB)ELISA檢測試劑盒 產(chǎn)品僅供教研使用用于定量檢測細胞培養(yǎng)上清、血清、血漿中小鼠CTSB 使用本產(chǎn)品之前，必須完整閱讀本說明書。僅供科研使用，不能于臨床診斷或治療。 簡介 組織蛋白酶B（CTSB），由CTSB基因編碼屬于溶酶體蛋白酶家族，在細胞內(nèi)蛋白水解中起著重要作用。它在新陳代謝過程中在肌肉組織中產(chǎn)生。它可以增強其他蛋白酶的活性，包括基質(zhì)金屬蛋白酶，纖溶酶酶激活劑）和組織蛋白酶D，因此它對細胞外基質(zhì)組分的蛋白水解，細胞間通訊破壞和蛋白酶抑制劑表達降低具有重要作用。它還參與自噬和分解代謝，這在腫瘤惡性腫瘤中是有利的，并且可能參與特定的免疫抵抗。它的過表達與浸潤性和轉(zhuǎn)移性癌癥相關(guān)。多種疾病導(dǎo)致CTSB水平升高，導(dǎo)致許多病理過程，包括細胞死亡、炎癥和有毒肽的產(chǎn)生。 本試劑盒小鼠CTSB免疫測定是一種三步法固相夾心ELISA，用于測量細胞培養(yǎng)上清液、血清和血漿中的小鼠CTSB。試劑盒包含大腸桿菌表達重組小鼠CTSB和針對重組蛋白產(chǎn)生的抗體。使用天然小鼠CTSB獲得的結(jié)果顯示出與使用重組標準品獲得的標準曲線平行的線性曲線。這些結(jié)果表明，該試劑盒可用于測定天然小鼠CTSB的相對質(zhì)量值。 檢測原理 試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術(shù)：將捕獲抗體包被于酶標板上，捕獲樣品及標準品中的待測物CTSB，孵育清洗后，再加入標記的檢測抗體進行孵育后清洗，形成“捕獲抗體-抗原-檢測抗體"免疫復(fù)合物，隨后加入鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶進行孵育，待孵育結(jié)束后清洗，接著加入TMB顯色液后，若樣本中有待測物則顯藍色，則加入終止液停止反應(yīng)。檢測過程中游離的成分均被洗去，用酶標儀在450nm處測OD值，顏色的深淺和樣品中的待測物的含量呈正比，通過繪制標準曲線計算出樣本中CTSB的濃度。 雙抗體夾心模式圖 按操作順序形成抗體夾心結(jié)構(gòu)后，加入TMB 底物，板孔液體由無色變成藍色，再加入終止液變?yōu)辄S色后進行吸光度值測定。 檢測實驗的局限性
僅供科研使用，不能用于臨床診斷或治療。 試劑盒的使用期限不得超過試劑盒標簽上的有效期。不要將試劑與其他批次或來源的試劑混合使用或替換使用。 如果樣品產(chǎn)生的值高于標準，則用測定稀釋劑進一步稀釋樣品，并重復(fù)測定。稀釋劑、實驗員、移液技術(shù)、洗滌技術(shù)、培養(yǎng)時間或溫度以及試劑盒使用年限的任何變化都可能導(dǎo)致結(jié)合變化。 樣本采集、處理和存儲的變化可能會導(dǎo)致樣本值的差異。 本試劑盒實驗設(shè)計消除了不同生物樣品中可能潛在的干擾因素的影響，但并不能涵蓋所有潛在影響因素。不能排除存在其他干擾的可能性。 操作要點 混合蛋白質(zhì)溶液時，應(yīng)始終避免起泡。為了避免交叉污染，在添加每個標準品、樣品和試劑時應(yīng)更換移液器槍頭。此外，每種試劑應(yīng)單獨使用容器。 確保試劑不間斷地添加到板孔中。為了確保準確的結(jié)果，在孵育步驟中需要粘合好封板膜。 當(dāng)使用自動洗板機時，在加入洗滌緩沖液后加入30秒的浸泡期，或者在洗滌步驟之間將板旋轉(zhuǎn)180度，可以提高測定精度。 顯色劑應(yīng)保持無色，直到添加到板中。確保顯色劑不受光線照射。顯色劑應(yīng)從無色變?yōu)樗{色。 應(yīng)按照與顯色劑相同的順序?qū)⒔K止液添加到板中。加入終止液后，孔中形成的顏色將從藍色變?yōu)辄S色。綠色的孔表示終止液未與基質(zhì)溶液充分混合。 試劑盒組成及儲存條件 名稱 | 規(guī)格（48T） | 規(guī)格（96T） | 儲存條件 | 預(yù)包被酶標板 | 8×6條 | 8×12條 | 未用完的酶標板密封干燥保存可于2-8℃儲存至多1個月。 | 標準品 | 1支×100μL | 1支×200μL | 每次測試按需配置標準品，剩余置于2-8℃儲存至多6個月。 | 100×化抗體 | 1支×50μL | 1支×100μL | 每次測試按需配置抗體工作液，剩余置于2-8℃儲存至多6個月。 | 100×SA-HRP | 1支×50μL | 1支×100μL | 每次測試按需配置酶結(jié)合物工作液，剩余置于2-8℃儲存至多6個月。 | 20×濃縮稀釋液 | 1支×15mL | 1支×25mL | 置于2-8℃可保存至有效期末。 | 顯色液A | 1支×3mL | 1支×6mL | 顯色液B | 1支×3mL | 1支×6mL | 終止液 | 1支×3mL | 1支×6mL | 20×濃縮洗滌液 | 1支×15mL | 1支×25mL | 封板膠紙 | 2張 | 2張 | 產(chǎn)品說明書 | 1份 | 1份 |
需要的其他材料 1. 酶標儀，包含450nm測定波長，同時包含600-680nm校正波長更佳； 2. 移液器及槍頭； 3. 蒸餾水或去離子水； 4. 100-1000 mL刻度量筒； 5. 洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機； 6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度； 7. 用于稀釋標準品和樣品的試管。 樣品預(yù)處理 下面列出的樣品收集和儲存條件旨在作為一般性指導(dǎo)。樣品穩(wěn)定性尚未評估。 細胞培養(yǎng)上清液： 在1000×g下離心15分鐘去除顆粒，立即進行測定或等分裝樣品，并將樣品儲存在≤-20℃的溫度下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。 血清： 使用血清分離管，使樣品在室溫下凝結(jié)30分鐘，然后在1000×g下離心15分鐘。立即取出血清并進行測定或等分裝樣品，將樣品儲存在≤-20℃的溫度下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。（由于基質(zhì)效應(yīng)，血清樣品建議2倍稀釋。例如：50μL樣品+50μL的1×稀釋液） 血漿： 使用EDTA或肝素作為抗凝劑收集血漿。收集后30分鐘內(nèi)，以1000×g離心15分鐘。立即測定或等分裝樣品，并將樣品儲存在≤-20℃的溫度下。避免重復(fù)凍融循環(huán)。（由于基質(zhì)效應(yīng)，血漿樣品建議2倍稀釋。例如：50μL樣品+50μL的1×稀釋液） 注：檸檬酸鹽抗凝劑血漿未經(jīng)驗證可用于本試驗，使用時應(yīng)自行驗證可行性。溶血的樣品不適合用于該測定。 組織勻漿： 用預(yù)冷的PBS(0.01M,pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響檢測結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應(yīng)9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨或勻漿機研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復(fù)凍融。將勻漿液于5000×g離心5-10分鐘，取上清檢測。 細胞裂解液： 貼壁細胞用預(yù)冷PBS輕輕清洗，然后用消化，1000×g離心5分鐘后收集細胞；懸浮細胞可直接離心收集。收集的細胞用預(yù)冷PBS清洗3次，每1×106個細胞中加入150-200μL的PBS重懸（推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑；若含量很低可適當(dāng)減少PBS體積）并通過反復(fù)凍融或超聲使細胞破碎。將提取液于2-8℃，1500×g離心10分鐘，取上清檢測。 其它樣本類型： ? 1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。 試劑準備 使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。 洗滌液/稀釋液配置 如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水） 標準品配置 試劑盒中取出標準品，準備7個試管，先從200ng/mL標準品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋10ng/mL（例：50μL的標準品母液+950μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的10ng/mL濃度標準品），隨后在6個試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個單獨的試管中10ng/mL標準品依次2倍倍比稀釋至6個梯度，共配制7個濃度的標準品，依次為： 10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.313ng/mL、 0.156ng/mL，從濃度標準品溶液中吸取500μL標準品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進行標準品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標準品(0ng/mL)
備 注： 如待測樣本中CTSB濃度高于標準品值，請根據(jù)實際情況選擇適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù) (建議：將待測樣本用樣品稀釋液稀釋1倍，在正式實驗之前做預(yù)實驗，以確定具體稀釋倍數(shù)) ；標準品母液、100×化抗體溶液及100×SA-HRP溶液請根據(jù)實驗所需酶標板孔數(shù)吸取一定量配置工作液，剩余溶液應(yīng)放回2-8℃儲存。
實驗步驟 所有標準品、樣品建議復(fù)孔檢測 1. 酶標板準備：確定試驗所需要的孔數(shù)，取下未使用的酶標條放回裝有干燥劑的鋁箔袋。 2. 樣本孵育：每孔分別加入100μL不同濃度的標準品以及預(yù)處理過的待測樣品，蓋上封板膠紙，37℃避光反應(yīng)1.5h。孵育結(jié)束后，每孔加入300μL 1×洗滌緩沖液，輕輕晃動30秒，甩干并在紙上拍干，以這種方式清洗3次。 3. 抗體孵育：每孔加入100μL化抗體工作液，輕輕混勻，蓋上封板膠紙，37℃避光反應(yīng)1h。孵育結(jié)束后，重復(fù)步驟2中的清洗方式清洗4次。 4. 酶標孵育：每孔加入100μL 1×SA-HRP工作液，蓋上封板膠紙，37℃避光反應(yīng)30分鐘，清洗4次，拍干。 5. 底物顯色：每孔首先加入50μL顯色液A，隨后加入50μL顯色液B，輕輕混勻，蓋上封板膠紙，37℃避光反應(yīng)15分鐘。（根據(jù)樣品和對照抗體的顏色，自行控制顯色時間） 6. 終止反應(yīng)：待顯色反應(yīng)結(jié)束后，每孔加入50μL終止液，輕輕混勻，5分鐘內(nèi)用預(yù)熱完成的酶標儀在450nm處測吸光值。 靈敏度 經(jīng)樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為0.08ng/mL。 線性關(guān)系 分別在選取的4份健康小鼠血清、血漿和細胞培養(yǎng)上清中加入高濃度5AR，在標準曲線動力學(xué)范圍內(nèi)進行稀釋，評估線性。 特異性 該試劑盒測定可識別天然和重組小鼠FPR1。 其他相關(guān)蛋白在稀釋緩沖液中制備為50ng/mL，并測定交叉反應(yīng)性。沒有觀察到明顯的交叉反應(yīng)。 | 
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